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如何获取高质量的显微镜照片

日期:2019-07-17 10:36:44

  在原代细胞培养过程中,一张好的照片胜过千言万语。优质的照片可以传递细胞的形态、健康状况、纯度和密度。如果同时使用不同类型的2维显微镜技术,如相差、浮雕对比和等,可以为你所培养的细胞提供有价值的认识。

  相差通过将细胞的厚度转化成灰度级,增强了对比度。细胞的较厚区域,如细胞核,比细胞浆等较薄的区域更暗。这种技术对于评估细胞形态和培养中的纯度观察很有用。它也可以指明细胞的健康状态,如细胞质变暗,提示细胞可能受损或死亡。

  

  图1相差显微镜下人的角质细胞、内皮细胞和成纤维细胞形态的不同之处()

  

  浮雕对比度(也称为霍夫曼调制对比)呈现了一个阴影伪浮雕效果,它也可以用来评估培养的细胞的形态和纯度。 它特别有助于区分那些不同的细胞类型,如更扁平的细胞(如成纤维细胞)与更厚的、更圆的细胞(如上皮细胞)。如图2所示。

  

 

  与此相反,荧光显微镜使用紫外(UV)光激发/发射滤波器选择性地激发和显示荧光。它可用于观察荧光蛋白的细胞或免疫荧光染色的结果。免疫荧光染色使用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合,可用于检测细胞的特异性标记物,这也是评估培养细胞纯度的最佳方法之一。图3演示了如何用免疫荧光染色鉴定细胞类型和培养纯度。第1张图显示了几个β-tubulin III阳性的神经元在两个 DAPI阳性细胞核(红色箭头)的非神经元细胞中间。第2张 HUVEC图像显示的是一个纯度很高的培养细胞,广泛的表达内皮细胞的标志物CD31。第3张图像为人类星形胶质细胞,纯度也很高,标志物GFAP阳性染色分布广泛。

  

 

  虽然这些显微镜技术提供了不同方面的信息,联合使用这三种显微镜技术来观察你所培养的细胞状态和纯度,是获取细胞状态的有效方法。

  

  拍摄高质量图片的技巧

香蕉影视在线观看免费  为了获取高质量和真实的显微镜图片,这些基本要素需要被考虑:显微镜配置、焦距和曝光。

 

  显微镜的配置

  首先要充分了解显微镜的使用情况。如果是新手,要请有经验的人示范正确的使用方法,或是在使用前认真阅读说明书。显微镜有许多可移动部件,哪怕其中一处设置错误,都可能会影响所拍摄图片的质量。熟练掌握显微镜的不同设置,并能根据需要选择合适的光路,将大大有助于解决使用过程中可能遇到的各种问题。

 

  焦距

  清晰的焦点是好图像的最重要特点,但却并不容易实现。虽然细胞在体外通常生长在二维表面上,但实际上细胞是三维的。那应该聚焦在细胞的哪个区域呢?对于使用相差和浮雕对比相差这类利用透射光线来观察整个细胞,通常理想的状态是聚焦在最薄的部分(图4A)而不是在胞体上(图4B)。为了做到这一点,可以一边观察细胞边缘,一边调整微调旋钮,直到边缘变得锐利。在荧光图像中,在核染色(通常是蓝色的Hochst或DAPI)窗进行聚焦,同时比细胞浆或粘附蛋白的聚焦效果好。聚焦后再用每种颜色进行微调,能确保感兴趣的颜色区域是锐利的。这将保证一旦颜色被合并,能得到完全清晰的图像。

 

  

 

  曝光

  曝光与图像中所能捕获的光的强度相关。对于相差和浮雕对比度的控制,可以通过调节透射灯的强度,或在软件中调整曝光时间来实现。过强的曝光会导致图片饱和度过高或过于明亮,从而缺少光强的变化(图5)。而太低的曝光将难以显现细胞(图5)。

 

  

 

  曝光对于荧光成像尤为重要,这可以通过图像捕获软件进行控制。最终的目标是获取一个很强的信号,但其强度却又至于过于饱和(图6)。成像软件可以用来调整图像对比度,并减少背景荧光,但这首先要保证一个合适的信号强度。不过,不能应用成像软件来降低饱和度。值得注意的是,你不能过度处理图像,从而歪曲了其原型。

  

 

  总之,通过多种显微技术拍摄高品质的细胞图像是一种记录细胞生长和收集实验数据的宝贵方法。最初使用即获取高品质的图像可能具有一定的难度,但知识和实践终将引领成功!

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